学位論文

ヤツメウナギの祖先型ヘモグロビン Node 25 タンパク質の合成および機能解析

jpn

2014-03-24

Not Applicable (or Unknown)

2014-03-24

修士(理工学)

工学研究科生命機能学専攻; 指導教授: 常重アントニオ

脊椎動物のヘモグロビン(Hb)はα鋭と8鎖の2つずつからなる山監体構造をもつが、円口類のヤツメウナギやヌタウナギのHbは、酸素(oxy)型のときに単地体を、脱酸素(deoxy)型のときにて量体や四盈体構造をとることが報告されている。 本研究では、脊椎動物のHbが単益体から二量体を経て四畳体構造へと進む分子進化の過程において、獲得したHbの酸素結合の協同作用について新たな知見を得るために、現存する脊椎動物の中でも最も古い種とされる円口類のHbに注目した。 これまで当研究室では、現存する円口類Hbのアミノ酸配列をもとに作成した最尤系統樹(ML-tree)を用いてヤツメウナギの祖先型Hbに相当するNode25タンパク質を設計し、すでに岡遺伝子をクローニングしたプラスミド(pGEM・Node25)を得ている。 本研究では、大腸菌を宿主としたNode25遺伝子発現系を構築したのち、産生したNode25タンパク質の精製を行い、得られた精製標品を用いて、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、吸収スベクトルおよびCDスベクトルを測定した結果、得られた精製標品は分子量約14kDaの大きさを示し、補欠分子としてへムを有したへムタンパク質特有のスベクトルを示し、さらに円口類特有のCDスベクトルが得られた。 また、今井式自動酸素結合曲線記録装置を利用した機能解折を行った結果、Node25タンパク質はHbAよりも酸素親和性が低く、pHが酸性からアルカリ性側へ上昇するに従って階素親和性およびH副係数の地加がみられることから、60μMという低濃度においてもpH依存的にNode25タンパク質が協同作用を示し、小さなBohr効果を示したが、各種阻害剤による酸素親和性および協同作用に対する阻害効果はみられなかった。Node25タンパク質試料は、HbAよりも酸素親利性が低く、Node25タンパク質濃度が60、600、1,200μMと生理条件に近づくに従い、ヤツメウナギの天然型Hbと同様にして、酸素観和性の低下と協同性作用の増加傾向が見られた。

Thesis